Дмитрий Мадера — руководитель отдела молекулярной генетики компании BIOCAD, старший преподаватель СПХФУ, Ph.D.
В 2002 году закончил биологический факультет МГУ по специальности генетика. Защитил диссертацию на степень Doctor of Phylosophy in Biology по программе исследования функции и экспрессии генов в Массачусеттском университете, после чего работал в National Institutes of Health, изучая молекулярные аспекты развития раковых заболеваний и способы воздействия на них. В 2015 году возглавил лабораторию молекулярной генетики в компании BIOCAD, с тех пор занимается разработкой продуктов генной терапии. Автор международного патента, описывающего новую нуклеазу семейства Cas9 и статей в области развития онкологических заболеваний.
Эксперимент Хэ Цзянькуя, риск онкологии у родившихся девочек и офтаргетные мутации
— Что вы думаете об эксперименте китайского биофизика Хэ Цзянькуя, отредактировавшего геном двух эмбрионов? Эксперты утверждают, что у родившихся девочек могли возникнуть мутации. Как избежать подобного?— Изучив первоисточник (исследование MIT — «Хайтек») и комментарий генетика Федора Урнова, я понял, что СМИ немного передергивают информацию. Да, у девочек с большой вероятностью могут быть мутации. Имеются в виду те мутации, о которых не известно, где именно они возникнут. А теперь уже и сложно установить, где именно возникли случайные мутации, явившиеся результатом воздействия CRISPR/Cas9. Для этого нужно провести сравнение с родителями девочек.
Формально это правильное утверждение: офтаргетные мутации действительно могут быть. И с этим уже ничего не сделаешь. И современные методы генного редактирования этого не предотвращают. В этом, собственно, и проблема, потому что это может быть опасно.
В конце 2018 года китайский ученый Хэ Цзянькуй объявил о том, что сумел создать генетически модифицированных девочек-близнецов с врожденным иммунитетом к ВИЧ. Он рассказал, что редактировал эмбрионы пар, проходящих процедуру ЭКО, и одна из семи попыток оказалась успешной. Эксперимент вызвал новую волну дискуссий об этичности вмешательства в генетический код человека.
Однако Федор Урнов, специалист по редактированию генома в Калифорнийском университете, в интервью журналу MIT Technology Review отметил: «утверждение о том, что он воспроизвел превалирующий вариант CCR5, является вопиющим искажением фактических данных», и добавил, что это можно описать только как «преднамеренное введение в заблуждение».
Новое исследование от MIT показало, что ученые не смогли воспроизвести превалирующий вариант CCR5. Хотя команда была нацелена на нужный ген, исследователи не копировали требуемую вариацию Delta 32, а вместо этого создавали новые редакции, эффект которых не ясен — при этом они могут вызывать мутации.
Утверждать, что Хэ Цзянькуй не смог мутировать ген CCR5 (ген, который позволяет ВИЧ поражать клетки человека — «Хайтек»), некорректно. Он действительно достиг своей цели, и CCR5 был действительно мутирован и больше не работает, а значит, ВИЧ не может поражать клетки. Да, он, видимо, не смог воспроизвести конкретный природный аллель, встречающийся в человеческих популяциях, но, тем не менее, CCR5 «нокаутирован», не работает, а значит, Цзянькуй достиг минимальной поставленной цели.
Чтобы предотвратить офтаргетные мутации, необходимо улучшать методы редактирования генома, повышать их точность. Таким образом в будущем получится снизить риск возникновения мутаций до бэкграундного уровня, а дальше успокоиться на том, что мутации происходят и естественным путем. Как говорится, не надо быть святее Папы Римского.
— То есть, когда эти девочки вырастут, понять, какие именно мутации у них возникли вследствие действий Цзянькуя, будет нереально?
— Если говорить конкретно о CCR5, то, конечно, можно. А по всему геному — в принципе, можно и сейчас, если взять генетический материал их папы и мамы и сравнить с их собственным. Тогда станет ясно, какие варианты есть у родителей, а каких из тех, что присутствуют в геноме девочек, нет ни у мамы, ни у папы. Другое дело, что будет невозможно узнать, какие из мутаций возникли вследствие CRISPR/Cas, а какие случайным образом. Можно будет лишь сравнить частоту этих мутаций: сколько в норме возникает мутаций при рождении ребенка и сколько их у этих девочек. Если их будет на порядок больше, тогда всё понятно.
Технология геномного редактирования CRISPR/Cas9 потенциально может уничтожить тысячи наследственных заболеваний, которые ранее считались неизлечимыми.
Главное отличие инструмента генного редактирования CRISPR/Cas9 от других, достаточно долго существующих способов — это возможность направленного изменения ДНК. CRISPR/Cas9 позволяет точечно влиять на последовательность ДНК и даже менять сломанный ген на правильный. Для этого специальный фермент нуклеаза вносит разрыв в нужное в геноме место, после чего включается система репарации — внутренние механизмы клетки по восстановлению генома. При этом ДНК репарируется в месте разрыва, как правило, со случайными ошибками, что, вероятнее всего, приведет к потере или вставке нескольких букв в последовательности и появлению мутаций. Поэтому она ищет в качестве образца нужную последовательность в соседних геномах. Согласно технологии, клетка должна найти эту последовательность в специальных фрагментах ДНК. Их генетики внедрили в клетку для того, чтобы взять ее и самостоятельно внедрить в саму себя. Однако случайные мутации в месте разрыва возникают гораздо чаще, чем направленная репарация по образцу.
Другой вопрос, Константин Северинов (российский специалист в области молекулярной биологии и CRISPR/Cas — «Хайтек») в свое время высказал любопытную мысль, что если бы там было что-то совсем страшное, девочки просто бы не выжили еще на стадии эмбриогенеза. Скорее всего, ничего фундаментального в их геноме не было затронуто. Единственное, что меня пугает — это онкология. Я очень надеюсь, что у них не будет подобных заболеваний.
— Почему? Возникновение онкологии становится вероятнее в результате редактирования генома человека?
— Конечно. Взглянем на причины возникновения рака. Их три: наследственные мутации, то есть специальные аллели, которые несут в себе вероятность повышения рисков возникновения рака, как, например, у Анджелины Джоли; вирусные причины — вирус папилломы человека, например; и случайные мутации. Именно возникновения мутаций последнего типа у девочек из китайского эксперимента я и опасаюсь, особенно если там была высокая частота возникновения мутаций. Тогда вероятность возникновения опухолей какого-либо типа отлична от нуля.
Как редактировать геном человека, страны-лидеры и судьба российской генетики
— Насколько проще проводить подобные эксперименты с животными?
— Для редактирования генома каждого животного необходим свой собственный протокол. Редактировать мышь или корову нужно с разными протоколами. И человек, как еще одно животное, требует его развития для самого себя, чтобы редактировать его геном наиболее эффективно. Поэтому нельзя сказать, что человека редактировать сложнее, чем корову. Просто нужно это делать иначе, чем в случае с мышью или крысой. Но подходы остаются такими же. Ничего сильно отличного в нас нет.
— То есть проблема лежит лишь в области этики и законов? И если бы ее решили, то экспериментов было бы больше?
— Безусловно. А потом, экспериментов достаточно много на самом деле. Я езжу на конференции и часто встречаю коллег. Например, в Орегонском университете проводят прекрасные эксперименты по редактированию генома человека и выращиванию эмбрионов. Просто их впоследствии уничтожают на определенном, раннем этапе. Подобные эксперименты не запрещены. По сути, единственное ограничение — подсаживание эмбриона и его выращивание вплоть до рождения.
— Какие страны сегодня в лидерах исследований по редактированию генома человека?
— Таких лидеров сейчас два, между ними и всеми остальными абсолютная пропасть. Это США и Китай. Дальше даже близко никто не стоит, настолько они оторвались в своих исследованиях от всего остального мира.
— Это связано с финансированием или научной базой?
— И с тем, и с другим. Китай вкладывает в исследование очень большие деньги, их власть это очень заботит. И если раньше они занимались простым копированием технологии, сейчас уже китайские ученые делают интересные вещи. А в США просто очень сильная научная база. Собственно, где были открыты все эти CRISPR/Cas — большинство первооткрывателей этого метода, кроме Дженнифер Дудны, китайцы, но работают они в США. Поэтому получилась такая синергия двух стран.
— А что мешает России развиваться в этой области? Даже президент заявил о приоритете исследований в направлении генетики.
— Скажу так, сегодня уже есть финансирование исследований — много выделяется денег. Но, конечно, это всё в один час не делается. Нужны научная база и школа. В России в плане генетики всё печально после лысенковщины. До Лысенко советская школа генетики была одной из лучших в мире. Вавилов ездил к Моргану (Томас Морган — один из основоположников генетики, лауреат Нобелевской премии — «Хайтек»), и они общались на равных. После Лысенко всё было уничтожено варварским способом. И с тех пор мы не можем восстановиться. Да, деньги — это очень важно. Но также необходимо, чтобы ребята шли учиться, чтобы привлекались иностранные специалисты. А будет школа — будет и геномное редактирование в России.
— Как на это повлияют недавние рекомендации относительно коммуникации между российскими и зарубежными учеными — сообщать обо всех контактах, практически доносить, как в Советском Союзе?
— Это очень страшно. Самое худшее, что можно сделать для российской науки и убить ее окончательно, — эти рекомендации. Причем я понимаю, что это всего лишь рекомендации, и их необязательно исполнять. Но люди же, сами понимаете, боятся. И начинают их выполнять превентивно. Особенно не ученые, а бюрократы от науки. Они начнут прекращать общение с иностранными учеными. Я знаю историю, когда супруги-ученые из Германии в кои-то веки приехали на какую-то конференцию в Россию, а зарубежные ученые не часто ездят к нам, и их не пустили на территорию мероприятия из-за этих предписаний. Наука интернациональна, и нужно как можно больше общаться и взаимодействовать с коллегами, и тогда будет толк. Я резко осуждаю эти предписания.
Лечение глухоты, опасные заболевания и доставка лекарств
— Российский генетик Денис Ребриков собирается отредактировать геном эмбрионов для пар с отклонениями слуха. Насколько вероятен успех подобного эксперимента?
— Денис Владимирович учел все ошибки своего китайского коллеги. Он собирается провести полное геномное секвенирование. И сам эксперимент будет проходить в более контролируемой обстановке, не в полуподпольных условиях, как это было у Цзянькуя. Я думаю, что успех в принципе, с методологической точки зрения, возможен, и окажется, что всё не так страшно, особенно при использовании современных методов. А уровень мутирования может оказаться на уровне бэкграунда. А что касается этих больных детей, то да, это моногенная мутация, причем она доминантна, то есть ее достаточно просто уничтожить, что генетики уже хорошо делают. И, собственно, всё, дальше ничто не стоит на пути.
— Как это сочетается с российским законодательством?
— Что касается законодательных аспектов, Ребриков над этим как раз и работает. И в этом смысле очень интересно узнать, что там получится. Мне бы очень хотелось, чтобы у него получилось пробить эту законодательную стену. Хотя его пример и то заболевание, которое он выбрал, на взгляд многих моих коллег и мой тоже, не так уж и актуальны. Но поле-то открывается огромное, поэтому пусть он будет первым и покажет хороший результат. И дальше можно будет расширять «репертуар».
— Какие еще опасные заболевания можно лечить с помощью CRISPR/Cas?
— Конечно, муковисцидоз — это очень тяжелое заболевание. Можно использовать генное редактирование в лечении миодистрофии Дюшенна, хотя бы у некоторых пациентов, у которых более-менее подходящая для этого мутация. Вообще моногенных генетических болезней более 10 тыс. И тут вопрос, какой метод более удобен и прост для лечения. Например, спинальную мышечную атрофию нужно лечить не редактированием, а просто заместительной генной терапией.
Муковисцидоз — системное наследственное заболевание, обусловленное мутацией гена трансмембранного регулятора муковисцидоза и характеризующееся поражением желез внешней секреции, тяжелыми нарушениями функций органов дыхания. Муковисцидоз представляет особый интерес не только из-за широкой распространенности, но и потому, что это одно из первых наследственных заболеваний, которое пытались лечить. Впервые муковисцидоз был признан отдельной нозологией Дороти Андерсен в 1938 году.
Миодистрофия Дюшенна — вызывается делециями или дупликациями одного или нескольких экзонов либо точечными мутациями в гене дистрофина. Основное проявление — слабость мышц, затруднения при движениях с детского возраста, которые прогрессируют с течением времени. Смерть обычно наступает на втором-третьем десятилетии жизни. Средняя ее продолжительность составляет 25 лет, однако есть люди, которые живут дольше.
— Когда ученым удастся это сделать? Назовите хотя бы временной диапазон?
— Смотрите, сейчас животных уже лечат. Правда, сначала «калечат», конечно (то есть делают модельных животных для изучения заболеваний), а потом лечат. Но всё это только выходит на осознанную клинику, а она, как правило, длится от 5 до 15 лет. И я так понимаю, поскольку это совершенно новый подход, то первые клинические исследования будут длиться очень долго. А значит, лет 15–20 придется подождать. Тогда это будет выглядеть уже следующим образом — приходите, диагностируют и сразу же лечат.
— То есть уже речь не о редактировании генома эмбрионов, а о лечении взрослых людей?
— Оба подхода будут возможны.
— Поговорим о генном редактировании без двойного разрыва. Почему до этого ученые не могли его сделать?
— Дело в том, что это совсем нелегко. Когда я сначала прочитал публикацию в Nature, то подумал: «Эх, как же я до этого не додумался». Кроме шуток, это была большая работа, потому что изначально подобная идея присутствовала, но когда ученые ее опробовали, у них ничего не получилось. Потом они начали изменять обратную транскриптазу, фактически ее мутировать, чтобы она работала по-другому. И уже на определенной итерации она заработала и стала что-то такое продуцировать. Это был процесс, который требовал много времени и финансирования. Поэтому я не удивлен, что с момента изобретения просто CRISPR/Cas и до момента появления метода с использованием обратной транскриптазы прошло время. Потому что это нетривиально.
— Какие возможности открываются благодаря этому новому методу?
— Возможности большие, потому что теперь получается, что мы можем с минимальными рисками возникновения офтаргетных мутаций очень специфически менять любой ген, аллель. Например, если мы хотим установить какую-либо точечную мутацию, создать делецию или сложную замену. Это дает нам большие возможности, потому что, по большому счету, обычно одна-две мутации или делеция, которые возникают, небольшого размера, и их можно восстановить в пределах 40–50 нуклеотидов.
На самом деле чуть раньше были технологии — нуклеотидные редакторы, которые просто брали и заменяли, например, «А» на «Г» или «Ц» на «Т». Такие были работы и они до сих пор применяются, но там, конечно, всё не просто, потому что оказывается, что они редактируют не только ДНК, но и РНК тоже, и точность у них не сказать, что очень большая — они редактируют не точно один нуклеотид, а целое «окно». Может быть, это тоже впоследствии разовьется до практического использования. Но пока там много проблем. Я вспомнил про этот метод, потому что он тоже не предполагает двухцепочечных разрывов. И он возник чуть пораньше, чем эти последние исследования.
— Инженеры из Массачусетского технологического и Гарвардского университетов использовали CRISPR для создания системы доставки лекарств, которая высвобождает их только в определенный момент. Как именно это происходит?
— Если говорить конкретно об этом способе, то его суть сводится к тому, что ДНК — это полимер, а Cas12a его разрезает, тем самым разрушая полимерную структуру. Если ДНК при этом инкорпорирована в гидрогель, то из него после этого начинают высвобождаться вещества, которые до того были закреплены в гидрогеле нитями ДНК. То есть здесь ДНК выступает просто как физический материал, который можно контролируемо разлагать. А вообще гидрогели используются на ранах и прочих повреждениях, когда необходимо постепенное высвобождение лекарств из них.
В принципе, CRISPR/Cas может доставлять что-то необходимое к позиции в геноме. Это все, что он может делать. А доставить лекарство в клетку — не может. Так что не совсем корректно говорить о его использовании для доставки лекарств.
Но чтобы доставить CRISPR/Cas в качестве лекарства в клетку, необходимы методы доставки. И они существуют — могут быть вирусными и невирусными. Вирусы, понятное дело, эволюционировали в течение всей своей истории, чтобы доставлять некий генетический материал в клетку. Они так размножаются. А невирусные методы — просто химические способы, когда создаются некие носители, содержащие внутри себя молекулы нуклеиновой кислоты, не обязательно ДНК, кстати, это может быть даже РНК или белок. Обычно они из себя представляют некие капельки жира, которые экранируют то, что они должны доставить от нуклеаз и протеаз, также на них можно навешивать антитела, чтобы придавать им специфичность для конкретной клетки. И эти липофильные комплексы доставляют лекарства в клетку. А есть работы, связанные со сложными полимерами или золотыми наночастицами, которыми как из пушки палят по клеткам, они влетают в них и доставляют свое содержимое, этакая геномная пушка.
— Возможно ли существенно продлить жизнь человеку благодаря генному редактированию? Насколько это можно сделать и какие болезни нужно вылечить таким образом?
— Сложный вопрос. Дело в том, что есть мутации, которые на животных вызывают некое продление жизни, замедление старения. Обычно они связаны с системой репарации ДНК. Во многом старение — это следствие накопления случайных ошибок, которые приводят к активации ретровирусных элементов, и в результате геном не регулируется и начинает работать против своего хозяина. Тут такой момент, мы не знаем, как это будет работать на людях. К сожалению, и это стало большим сюрпризом, механизмы старения и защиты от него — очень видоспецифичны. И для человека те же мыши оказываются не совсем адекватной моделью. А чем адекватнее модель и чем дольше она живет, тем сложнее с ней работать. Например, тот же SIRT6 — у долгоживущих видов он один, а короткоживущих видов — другой, есть четкая корреляция. Казалось, возьми да вставь SIRT6 от слона к человеку. Или несколько копий человеческого SIRT6 (ген, кодирующий белок сиртуин-6, помогает исправлять повреждения в ДНК — двойные разрывы в цепях и замены в генетических буквах-нуклеотидах — «Хайтек»). Это может сработать, а может и нет. Вероятность такая есть, и я, конечно, попробовал бы. Но если и говорить о продлении жизни, то, вероятнее всего, нужно редактировать гены, связанные с репарацией ДНК. Сегодня, впрочем, для такого организма, как человек, это лишь гипотеза.