Метод основан на новом молекулярном маркере, называемом родамин-связывающим аптамером для методов визуализации сверхвысокого разрешения (RhoBAST). Этот маркер флуоресценции на основе РНК используется в сочетании с красителем родамином. Благодаря своим отличительным свойствам маркер и краситель взаимодействуют очень специфическим образом, что заставляет отдельные молекулы РНК светиться. Затем их можно сделать видимыми с помощью микроскопии локализации одиночных молекул (SMLM) — метода визуализации сверхвысокого разрешения. Из-за отсутствия подходящих флуоресцентных маркеров прямое наблюдение РНК с помощью оптической флуоресцентной микроскопии до настоящего времени строго ограничено.
RhoBAST разработан исследователями из Института фармации и молекулярной биотехнологии (IPMB) Гейдельбергского университета и Института прикладной физики (APH) в KIT. Созданный ими маркер является генетически кодируемым, что означает, что он может быть слит с геном любой РНК, продуцируемой клеткой. RhoBAST сам по себе не является флуоресцентным, но освещает проницаемый для клеток родаминовый краситель, связываясь с ним очень специфическим образом.
«Это приводит к резкому увеличению флуоресценции, достигаемому комплексом RhoBAST, что является ключевым требованием для получения превосходных флуоресцентных изображений. Однако для визуализации РНК сверхвысокого разрешения маркеру нужны дополнительные свойства».
Мурат Зюнбюль из IPMB
Исследователи обнаружили, что каждая молекула родаминового красителя остается связанной с RhoBAST только в течение примерно одной секунды, прежде чем снова отсоединиться. Через несколько секунд эта процедура повторяется с новой молекулой красителя. Довольно редко можно найти сильные взаимодействия, например, между RhoBAST и родамином в сочетании с исключительно быстрой кинетикой обмена. Поскольку родамин загорается только после связывания с RhoBAST, постоянная последовательность вновь возникающих взаимодействий между маркером и красителем приводит к непрерывному «миганию». Это «включение-выключение» — именно то, что нужно для визуализации.
В то же время система RhoBAST решает еще одну важную проблему. Флуоресцентные изображения собираются под воздействием лазерного излучения, которое со временем разрушает молекулы красителя. Быстрая замена красителя гарантирует, что фотообесцвеченные красители заменяются свежими. Это означает, что отдельные молекулы РНК можно наблюдать в течение более длительных периодов времени, что может значительно улучшить разрешение изображения.
Исследователи из Гейдельберга и Карлсруэ смогли продемонстрировать превосходные свойства RhoBAST, визуализировав структуры РНК внутри кишечных бактерий (Escherichia coli) и культивированных клеток человека с превосходной точностью локализации. Ученые смогли раскрыть детали ранее невидимых субклеточных структур и молекулярных взаимодействий с участием РНК, используя флуоресцентную микроскопию сверхвысокого разрешения. Это позволит получить принципиально новое понимание биологических процессов.
Читайте также:
Физики создали аналог черной дыры и подтвердили теорию Хокинга. К чему это приведет?