Каждый из живых организмов на Земле носит в клетках наследственный материал своих предков. Эти данные называются геномами, и они нужны непосредственно для создания и поддержания деятельности организма. Генная инженерия работает над изменениями в наследственной информации. Рассказываем, что происходит с редактированием геномов прямо сейчас.
Применение генной инженерии в научных исследованиях
- Нокаут гена
Для изучения функции того или иного гена может быть применён нокаут гена. Так называется техника удаления одного или большего количества генов, что позволяет исследовать последствия подобной мутации.
Для нокаута синтезируют такой же ген или его фрагмент, измененный так, чтобы продукт гена потерял свою функцию. Основные методы реализации: цинковый палец, морфолино и TALEN.
Для получения нокаутных мышей полученную генно-инженерную конструкцию вводят в эмбриональные стволовые клетки, где конструкция подвергается соматической рекомбинации и замещает нормальный ген, а измененные клетки имплантируют в бластоцисту суррогатной матери. У плодовой мушки дрозофилы мутации инициируют в большой популяции, в которой затем ищут потомство с нужной мутацией. Сходным способом получают нокаут у растений и микроорганизмов.
- Искусственная экспрессия
Логичным дополнением нокаута является искусственная экспрессия, то есть добавление в организм гена, которого у него ранее не было. Этот способ генной инженерии также можно использовать для исследования функции генов. В сущности процесс введения дополнительных генов таков же, как и при нокауте, но существующие гены не замещаются и не повреждаются.
- Визуализация продуктов генов
Используется, когда задачей является изучение локализации продукта гена. Одним из способов мечения является замещение нормального гена на слитый с репортерным элементом, например, с геном зеленого флуоресцентного белка GFP. Этот белок, флуоресцирующий в голубом свете, используется для визуализации продукта генной модификации.
Хотя такая техника удобна и полезна, её побочными следствиями может быть частичная или полная потеря функции исследуемого белка. Более изощрённым, хотя и не столь удобным методом является добавление к изучаемому белку не столь больших олигопептидов, которые могут быть обнаружены с помощью специфических антител.
- Исследование механизма экспрессии
В таких экспериментах задачей является изучение условий экспрессии гена. Особенности экспрессии зависят прежде всего от небольшого участка ДНК, расположенного перед кодирующей областью, который называется промотор и служит для связывания факторов транскрипции.
Этот участок вводят в организм, поставив после него вместо собственного гена репортерный, например, GFP или фермента, катализирующего легко обнаруживаемую реакцию. Кроме того, что функционирование промотора в тех или иных тканях в тот или иной момент становится хорошо заметным, такие эксперименты позволяют исследовать структуру промотора, убирая или добавляя к нему фрагменты ДНК, а также искусственно усиливать его функции.
Зачем нужна генная инженерия человека
В применении к человеку генная инженерия могла бы применяться для лечения наследственных болезней. Однако, технически, есть существенная разница между лечением самого пациента и изменением генома его потомков.
Задача изменения генома взрослого человека несколько сложнее, чем выведение новых генноинженерных пород животных, поскольку в данном случае требуется изменить геном многочисленных клеток уже сформировавшегося организма, а не одной лишь яйцеклетки-зародыша. Для этого предлагается использовать вирусные частицы в качестве вектора.
Вирусные частицы способны проникать в значительный процент клеток взрослого человека, встраивая в них свою наследственную информацию; возможно контролируемое размножение вирусных частиц в организме. При этом для уменьшения побочных эффектов учёные стараются избегать внедрения генноинженерных ДНК в клетки половых органов, тем самым избегая воздействия на будущих потомков пациента.
Также стоит отметить значительную критику этой технологии в СМИ: разработка генноинженерных вирусов воспринимается многими как угроза для всего человечества.
С помощью генотерапии в будущем возможно изменение генома человека. В настоящее время эффективные методы изменения генома человека находятся на стадии разработки и испытаний на приматах.
Долгое время генетическая инженерия обезьян сталкивалась с серьёзными трудностями, однако в 2009 году эксперименты увенчались успехом: в журнале Nature появилась публикация об успешном применении генноинженерных вирусных векторов для излечения взрослого самца обезьяны от дальтонизма. В этом же году дал потомство первый генетически модифицированный примат (выращенный из модифицированной яйцеклетки) — обыкновенная игрунка (Callithrix jacchus).
Хотя и в небольшом масштабе, генная инженерия уже используется для того, чтобы дать шанс забеременеть женщинам с некоторыми разновидностями бесплодия. Для этого используют яйцеклетки здоровой женщины. Ребёнок в результате наследует генотип от одного отца и двух матерей.
Однако возможность внесения более значительных изменений в геном человека сталкивается с рядом серьёзных этических проблем. В 2016 в США группа учёных получила одобрение на клинические испытания метода лечения рака с помощью собственных иммунных клеток пациента, подвергаемых генной модификации с применением технологии CRISPR/Cas9.
В конце 2018 года в Китае родились двое детей, геном которых был искусственно изменён (выключен ген CCR5) на стадии эмбриона методом CRISPR/Cas9, в рамках исследований, проводимых с 2016 года по борьбе с ВИЧ. Один из родителей (отец) был ВИЧ-инфицированным, а дети, по заявлению, родились здоровыми.
Поскольку эксперимент был несанкционированным (до этого все подобные эксперименты на человеческом эмбрионе разрешались только на ранних стадиях развития с последующим уничтожением экспериментального материала, то есть без имплантации эмбриона в матку и рождением детей), ответственный за него учёный не предоставил доказательств своим заявлениям, которые были сделаны на международной конференции по редактированию генома.
В конце января 2019 года властями Китая были официально подтверждены факты проведения данного эксперимента. Тем временем учёному было запрещено заниматься научной деятельностью и он был арестован.
Как редактируют человеческий геном?
- Метод «цинковые пальцы»
«Цинковые пальцы» встречаются и в составе человеческих белков. Благодаря этому методу можно сконструировать цепь ZFN так, что она будет узнавать определённый участок ДНК. Это дает возможность точечного воздействия на заданные участки в составе сложных геномов.
Домены «цинковые пальцы» встречаются в составе человеческих факторов транскрипции – белков, регулирующих процесс синтеза РНК с матрицей ДНК. При создании искусственных нуклеаз можно сконструировать цепочку из «цинковых пальцев» так, что она будет узнавать определенный участок ДНК.
Если такая цепочка будет достаточно длинной, она может распознавать относительно протяженные последовательности ДНК, состоящие из ряда тринуклеотидных фрагментов. Это означает реальную возможность точечного воздействия на заданные участки в составе больших сложных геномов.
Однако у метода «цинковых пальцев» обнаружились и серьезные недостатки: во-первых, это не вполне строгое распознавание тринуклеотидных повторов, что приводит к заметному числу расщеплений ДНК в «нецелевых» участках.
Во-вторых, метод оказался весьма трудозатратным и дорогостоящим, поскольку для каждой последовательности ДНК необходимо создать свою оптимизированную белковую структуру zinc-finger нуклеазы. Поэтому система «цинковые пальцы» широкого распространения не получила.
- TALEN
В 2011 году журнал Nature Methods назвал систему TALEN (Transcription Activator-like Effector Nucleases) «методом года» благодаря широкому спектру возможных применений в разных областях фундаментальной и прикладной науки.
TALEN — один из способов направленного внесения разрыва в ДНК с последующим его «залечиванием» — для выключения генов у мышей. Сразу после них эту технологию применили для внесения в мышиный геном мутации, приводящей к развитию одного из наследственных синдромов. Авторам метода моделирования генетически обусловленных болезней удалось не только «испортить» мышиный геном, но и исправить его обратно.
- CRISPR/Cas9
Метод обеспечивает точное воздействие на заданные участки ДНК и может быть использован практически в любой современной молекулярно-биологической лаборатории.
В основе этой системы — особые участки бактериальной ДНК — CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, или короткие палиндромные кластерные повторы). Разделяют эти повторы спейсеры — короткие фрагменты чужеродной ДНК. Последние встраиваются в геном после того, как ДНК рекомбинирует с её геномом.
Примеры редактирования человека
- Редактирование генома прямо в теле
Заболевание 44-летнего жителя Аризоны Брайана Мадо проявилось еще в раннем детстве. Оно неизлечимо и наследуют его в основном мужчины. Мукополисахаридоз II типа — это метаболическое расстройство: у людей с ним есть мутация в гене, ответственном за производство фермента, который участвует в расщеплении сложных углеводов. В итоге они накапливаются в клетках и вызывают многочисленные патологии органов.
Мужчина решил принять участие в клиническом испытании нового метода — генной терапии. Это лишь первая фаза исследования, а всего до регистрации терапии (то есть до разрешения применять этот метод для всех больных с синдромом Хантера) их должно быть три.
Метод, который использовали в случае Брайана Мадо, позволяет редактировать геном прямо в теле человека — и при этом достаточно точно попадать в конкретный участок ДНК. Редактирование происходит с помощью так называемых «цинковых пальцев».
- Генетически модифицированные дети
Китайский исследователь Хэ Цзянькуй отредактировал геномы человеческих эмбрионов перед процедурой искусственного оплодотворения, в результате чего на свет появились двое детей с измененной ДНК.
С помощью системы CRISPR/Cas9 исследователь отредактировал геномы эмбрионов семи пар во время репродуктивного лечения. В результате одной из беременностей от здоровой матери и ВИЧ-инфицированного отца родились две девочки-двойняшки с измененной ДНК. Хэ Цзянькуй пояснил, что удалил у детей ген CCR5, благодаря чему они получили пожизненный иммунитет к ВИЧ.
- Возвращение зрения с помощью генной терапии
Для восстановления зрения можно использовать оптогенетические технологии, с помощью которых работой нейронов можно управлять с помощью светочувствительных белков бактерий и вспышек лазера.
Руководствуясь этой идеей, биологи создали вирус, который может проникать в ганглионарные нейроны. Эти нервные клетки отвечают за передачу сигналов из сетчатки в мозг человека. Попавший в ганглионарный нейрос вирус заставляет его производить подобные сигнальные молекулы. Однако эта процедура не возвращает зрение сама по себе, так как белки бактерий реагируют на свет не так, как палочки и колбочки сетчатки.
Чтобы решить эту проблему, профессор Базельского университета Ботонд Роска и профессор Питтсбургского университета Хосе Сахель создали специальные очки, которые преобразуют поступающие в них изображение в понятный мозгу формат и стимулируют ганглионарные клетки вспышками лазера. В результате пациент может видеть силуэты крупных предметов и объектов и совершать другие сложные действия
Читать далее:
Ученые проверили теорию панспермии на тихоходках: они могут путешествовать в космосе
Ученые выяснили, что сверхобогащенное золото образуется как простокваша
Крошечный водородный двигатель заменил аналоги на ископаемом топливе