Лабораторию масс-спектрометрии «Сколтеха» возглавляет член-корреспондент Российской академии наук Евгений Николаев. Команда ученых, среди которых ассистент-профессор Юрий Костюкевич и спикер Сергей Осипенко, решает множество разных прикладных задач: от разработки новых приборов до молекулярной археологии. Одним из направлений деятельности лаборатории является изучение малых молекул, или метаболитов.
Что лежит в основе построения жизненных процессов
ДНК — это полимерные длинные цепочки, хранящие информацию о том, как должен выглядеть и функционировать организм. То есть о том, чем мы отличаемся от других видов и чем две особи одного вида отличаются друг от друга. Эти молекулы определяют нашу уникальность. Приведу такой пример: гусеница и бабочка, в которую она перерастает. Как вы думаете, у них молекулы ДНК разные или одинаковые? На самом деле, правильный ответ: одинаковые. Генетическая информация в ходе жизнедеятельности никак не меняется. Собственно, почему гусеница и бабочка в итоге разные? Потому что далеко не вся информация, которая в ДНК хранится, одновременно реализуется. Реализация происходит через процесс транскрипции, в результате чего после считывания отдельных генов матричная РНК позволяет синтезировать белки.
Белки — это универсальные молекулярные машины в нашем организме, выполняющие разные функции: от строительной до регуляторной. Одно из устаревших определений жизни — это упорядоченное существование и взаимодействие белковых молекул. Но проблема в том, что белковые молекулы тоже большие. Белки — это тоже полимерные молекулы с большой молекулярной массой: обычно от 10 до нескольких сотен килодальтон. И построить основные жизненные процессы на них довольно проблематично, потому что они достаточно чувствительны к изменениям температуры и внешней среды. И, вероятно, поэтому практически все жизненно необходимые процессы в клетке реализуются через малые молекулы. А превращением малых молекул друг в друга уже управляют белки. Молекулярная масса этих малых молекул: от нескольких десятков до нескольких сотен килодальтон. Все малые молекулы, которые находятся в живом организме, называются метаболитами.
1 дальтон, или 1 атомная единица массы (а. е. м.) — внесистемная единица массы, применяемая для масс молекул, атомов, атомных ядер и элементарных частиц.
1 а. е. м. = 1,660 539 066 60(50)⋅10−27 кг.
Первичные метаболиты — это химические вещества, которые есть во всех клетках организма и необходимы для обеспечения жизненно важных процессов. Из них строятся все полимерные молекулы, белки и нуклеиновые кислоты. Эти метаболиты для всех клеток одного организма одинаковы. В ходе жизнедеятельности метаболиты превращаются друг в друга, например, с целью переноса энергии. И вот такие пути превращения — цепочки превращения — называются путями метаболизма.
Разные пути метаболизма в организме человека пересекаются, то есть имеют общих участников. Таким образом все процессы, которые протекают с метаболитами, взаимосвязаны.
Вторичные метаболиты — это вещества, которые не необходимы всем клеткам для обеспечения жизнедеятельности. Обычно они используются для адаптации к условиям внешней среды. Например, кофейные растения вырабатывают кофеин для защиты своих листьев от вредителей. Они токсичны для жуков, которые пожирают листья кофейных растений. Но если мы каким-то образом уберем весь кофеин из растения, оно продолжит жить. Никакие жизненно важные процессы нарушены не будут. Второй пример — это антибиотики. Вы знаете, что пенициллин — это первый антибиотик, и он был совершенно случайно выделен из плесневых грибов, что совершило революцию в медицине. Плесневые грибы используют пенициллин для того, чтобы расчистить себе жизненное пространство. Он безвреден для родительского организма, а для других микроорганизмов токсичен. Собственно, это свойство человек и использует для лечения различных бактериальных инфекций. Из-за того, что человек активно потребляет растения в пищу, наш организм густо населен различными микроорганизмами, формирующими микрофлору. Эти вещества — вторичные метаболиты не только самого человека, но и живых организмов, которые неизбежно попадают в наш организм.
Природный фильтр и почему он ошибается
Ксенометаболиты — это антибиотики, соединения, которые с деятельностью живых организмов не связаны. Это, как правило, что-то, что человек получил искусственно с разными целями. Например, лекарства, пищевые добавки, БАДы, допинг, наркотики, продукты горения табака, алкоголь или средства гигиены, бытовая химия, экотоксиканты. Это тоже малые молекулы, и они попадают в организм как преднамеренно, в случае лекарств, так и случайно. Например, вы чистили зубы, проглотили зубную пасту — и так к вам попали новые химические вещества. И многие из этих веществ могут оказать определенное воздействие на наш организм, даже в очень маленьких концентрациях. Причем это воздействие может быть как положительным, так и отрицательным или меняться в зависимости от количества этого вещества.
Печень является первым барьером на пути проникновения чужеродных химических веществ в системный кровоток. Она пытается отфильтровать молекулы, которые организму навредят и вывести их, не пуская их дальше по кровотоку в органы. У печени много механизмов фильтрации, но ни один из них не срабатывает на 100%: иначе не было бы отравлений и тяжелых последствий приема всяких токсинов или наркотиков. Тем не менее, печень пользуется тем фактом, что наш организм в большей степени — это вода, то есть он процентов на 80 состоит из воды. Поэтому печень пытается отсортировать молекулы на гидрофильные, которые в воде растворяются, и на гидрофобные. Печень «считает», что если вещество гидрофильное, то его можно дальше пускать в системный кровоток, так как оно сильно навредить не должно. А если вещество гидрофобное, то с ним нужно что-то делать, чтобы не пустить его дальше или как минимум сделать его более гидрофильным.
У печени есть два механизма — фазы метаболизма. В первой фазе печень пытается с помощью специальных белков, ферментов семейства цитохром Р450 эти вещества окислить. В результате окисления структура молекулы меняется, и она может стать более гидрофильной. Дальше печень может пустить эти метаболиты в кровоток или попытаться вывести их через почки с мочой или через кишечник. Если это не срабатывает, печень может к этим окисленным молекулам «пришить» готовые гарантированно водорастворимые молекулы.
Печеночный метаболизм увеличивает разнообразие малых молекул, которые могут оказаться в нашем организме. Например, на стадии окисления из одной молекулы теоретически образуется больше чем 500 разных новых других молекул, предсказать, какие из них образуются, а какие нет, не представляется возможным.
Бесконечный «алфавит»: почему так трудно изучать метаболиты
Нуклеиновые кислоты можно представить в виде пятибуквенного алфавита, из которого строится большая текстовая строка. Да, конечно, последовательность букв в этой строке может быть относительно хаотичной, хотя в ходе жизнедеятельности ДНК не меняется, а просто копируется. Поэтому у нас есть определенные ограничения на то, какой будет эта строка. В случае с белками ситуация несколько сложнее: букв в алфавите будет уже 20, то есть 20 аминокислот, из которых построены белки, но и это происходит непроизвольным образом. Поэтому эти объекты, с точки зрения исследователя, тоже достаточно похожи между собой. А в случае с метаболитами выделить какой-то алфавит крайне проблематично: по сути это вся таблица Менделеева. А из правил формирования — только правило валентности. Кроме того, есть особенность химии углерода, которая позволяет двум атомам углерода связываться между собой и потом, впоследствии присоединять еще неограниченное количество атомов углерода или других атомов из таблицы Менделеева, что порождает огромное химическое разнообразие таких молекул.
Для изучения таких маленьких молекул и всего их разнообразия необходимы специальные методы. Есть простые: например, органолептический анализ, с которым сталкивался каждый, кто сдавал общий анализ крови или мочи и видел, что в направлении есть строчка «запах, цвет». Когда необходимо найти конкретную молекулу в растворе, туда добавляют каплю заранее выбранного реагента. Если молекула в растворе была, произойдет окрашивание, если не было — появится только осадок. Среди простых методов также есть оптическая спектроскопия, когда можно с помощью микроскопа по структуре осадка сделать выводы. Достаточно популярные сейчас — иммунохимические методы: это тот самый тест ИФА на COVID-19.
Омиксные исследования — это те исследования, в которых изучается некая полная совокупность. А метаболомика подразумевает анализ больших данных, которые представляют полный набор малых молекул в некотором организме, клетке или органе. Набор этих данных варьируется по разным оценкам от нескольких тысяч, если мы рассматриваем только первичные метаболиты, до нескольких десятков тысяч, если мы к ним присоединяем вторичные метаболиты известных растений, бактерий и грибов. На самом деле, до нескольких сотен миллионов, если учитывать все химическое разнообразие, которое может в организм человека попасть. И для их изучения нужны специальный методы: спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и масс-спектрометрия.
За 80-летнюю историю существования ЯМР ученые, занимавшиеся этим методом, получили пять нобелевских премий. Четыре — за ЯМР, и пятую — за магнитно-резонансную томографию. Метод, немного отличающийся от ЯМР-спектроскопии, но очень родственный по принципу. Метод ЯМР основывается на том, что некоторые атомы в таблице Менделеева имеют ненулевой магнитный момент. Они представляют собой маленькие магнитики и могут взаимодействовать с внешним магнитным полем. Это взаимодействие проявляется в расщеплении энергетических уровней. ЯМР-метод позволяет различать разные атомы и атомы одного элемента, но в разном окружении. В последнее время ЯМР теряет популярность, в первую очередь, из-за своей высокой стоимости.
Как сделать из сложной смеси заряженные частицы и выяснить их состав
Масс-спектрометрия — это метод разделения заряженных частиц за счет их взаимодействия с электромагнитным полем. Если взять некую сложную смесь, состоящую из разных заряженных частиц, а практически любую молекулу современными методами масс-спектрометрии можно перевести в заряженную форму, добавив к ней или оторвав от нее протон, и подействовать на эту смесь электромагнитным полем, то частицы в этом поле начнут двигаться и у них будет либо скорость, либо траектория, зависящая от массы. Легкие частицы прилетят к детектору раньше, чем тяжелые. После обработки данных с детектора получают масс-спектр, в котором по оси Y будет интенсивность сигналов, которая пропорциональна количеству ионов, а по оси X — массы в ионах, а вернее, соотношение массы к заряду. Причем масс-спектрометрия позволяет измерить массу с очень высокой точностью. А значит, можно однозначно установить элементный состав иона, заряженных частиц или молекулы, из которой он образовался. Математически это называется решение диофантового уравнения в целых числах: по факту это подбор коэффициентов возле каждого атома: m(C), m(H), k(O), z(N). И только одна комбинация целых чисел m, n, k, z может дать ту массу, которую померил масс-спектрометр.
Метод масс-спектрометрии был предложен в начале ХХ века Томпсоном. Ученые собрал первый в мире масс-спектрометр и с его помощью сделал великое открытие: экспериментально подтвердил существование изотопов. С другой стороны, он не смог дать корректную интерпретацию своим результатам. За него это сделал его ученик Уильям Астон: в 1922 году он за это открытие получил Нобелевскую премию. В ХХ веке из-за череды мировых войн масс-спектрометрия развивалась как метод для военных. Основное применение в начале своего развития она нашла в атомной промышленности. Поскольку масс-спектрометрия позволяет разделять вещества по массе и определять изотопы, значит, ее можно использовать для разделения изотопов, например, урана. За масс-спектрометрию было выдано еще две нобелевские премии: в 1989 году — Вольфганг Пауль и Ханс Демельт, а затем в 2002 году — настоящую революцию совершили независимо друг от друга Джон Фенн и Каиши Танака. Они предложили свой метод, позволяющий получить заряженную частицу из большой полимерной молекулы: из белков или из нуклеиновых кислот, не разрушив ее. Это дало толчок изучению. Сейчас ни одна лаборатория — биохимическая или лаборатория молекулярной биологии — без собственного масс-спектрометра или без хорошо оснащенного центра коллективного пользования в институте работать не может.
Определив массу иона, мы можем определить только элементный состав, но не структуру молекул. Потому что одному элементному составу разных структур может соответствовать огромное количество. То есть атомы в молекуле можно расположить по-разному. Это называется явлением изомерии.
Масс-спектрометристы придумали способ, позволяющий получить немножко больше информации о структуре молекулы: на пути летящих ускоренных молекул ставится некое препятствие. Обычно это молекулы газа. Когда молекулы сталкиваются с этими молекулами газа, они могут развалиться на части от такого столкновения. И дальше масс-спектрометр измеряет массу уже не исходной молекулы, а тех кусочков, на которые она распалась. А распад этот происходит не случайным образом, а по самым слабым связям в молекуле. В результате получаются одинаковые фрагменты, и они являются молекулярными отпечатками пальцев: уникальными для каждой молекулы.
Хроматография — это метод разделения веществ, основанный на их взаимодействии с сорбентами. Сорбенты — это то, что может впитать в себя другие химические вещества, и самый простой — это активированный уголь, который мы принимаем при отравлении. В начале ХХ века русский ученый Михаил Цвет продемонстрировал, что если такой природный краситель пропустить через колонку, заполненную мелом, то вместо одного большого зеленого размазанного пятна получится несколько разноцветных пятен: от желтого до зеленого. Тем самым он, во-первых, понял, что зеленый краситель из листьев — это смесь разных веществ. А, во-вторых, открыл хроматографию, за которую в 1952 году уже другим ученым, которые довели его метод до некоторого современного вида, присудили Нобелевскую премию. В современной хроматографии смесь проходит через колонку при помощи жидкости или газа, в зависимости от типа хроматографии. Жидкость «тащит» молекулы вперед, к выходу из колонки, а сорбент мешает каждой молекуле по-разному. В итоге они выходят из колонки в разное время, которое можно зафиксировать и использовать как еще один отпечаток для идентификации.
От исследования спинномозговой жидкости до метода сухой крови
Метод масс-спектрометрии — это единственно пригодный на сегодня метод изучения спинномозговой жидкости. В некоторых сложных случаях для диагностики заболеваний требуется пункция, прокалывается позвоночник и отбирается образец спинномозговой жидкости. Но проблема в том, что спинномозговой жидкости у человека в среднем всего 120 мл. И жидкость эта находится под давлением, поэтому отбор даже 1 мл существенно влияет на это давление и может привести к необратимым последствиям для организма. Поэтому отобрать на самом деле можно только несколько микролитров. Ни один из существующих методов, кроме масс-спектрометрии, не может работать с такими маленькими количествами образцов, потому что чем меньше образец, тем меньше у него молекул и тем чувствительнее должно быть ваше оборудование. Чувствительности масс-спектрометрии обычно для этого хватает. После забора образец избавляют от механических включений и белков, чтобы избежать поломок приборов. После анализа результат обрабатывают с помощью компьютера и получают «список признаков»: на выходе это примерно 10–15 тыс. строчек. В столбцах получается формула, которую мы определяем с точной массой, интенсивность, которая пропорциональна количеству этой молекулы, и «отпечатки пальцев».
Наиболее прямой метод применения такого метаболомного масс-спектрометрического эксперимента — сравнение больных и здоровых людей для выявления того, какие молекулы проявляются, появляются и меняют свою концентрацию при возникновении такого различия. Обычно берут две группы: людей здоровых и людей с заболеванием нас интересующим, например, с какой-то конкретной формой онкологии. Для каждого образца получают такие таблички, а дальше математики сравнивают и визуализируют их, чтобы найти между ними отличия.
Первая сфера применения масс-спектрометрии — это неонатальный скрининг. Каждого новорожденного, по приказу Минздрава с 2006 года, обязательно тестируют на некий набор наследственных заболеваний. Сейчас, во всяком случае, в Москве тестируют как минимум на 16 разных болезней. Есть такие заболевания, и они часто проявляются прямо с первых минут жизни, которые если вовремя не купировать, через неделю или несколько дней могут сделать ребенка инвалидом на всю жизнь. Поэтому такую диагностику необходимо производить в течение нескольких первых часов жизни новорожденного. Биомаркерами практически всех этих заболеваний являются малые молекулы-метаболиты. То есть болезни проявляются в виде сбоев в метаболизме, например, накоплении определенных органических кислот в крови или некоторых липидов. И, естественно, это накопление происходит в очень небольших концентрациях, по ним необходимо распознать разницу в изменении метаболизма. Поэтому, кроме масс-спектрометрии, здесь никакой другой метод работать не будет.
Чтобы решить проблему с забором крови у детей (не такое большое количество крови и страх детей перед инвазивными методами и врачами), придумали технологию анализа сухих пятен крови. Делается маленький прокол, и отбирается одна или две капли крови прямо на небольшой кусочек фильтровальной бумаги. Объем крови здесь — несколько микролитров. Потом эта карточка высушивается и отправляется в лабораторию, причем отправка происходит тоже очень удобно: образец не надо ни замораживать, ни размораживать. Просто перерастворить эту карточку, и на анализ, и в течение нескольких часов анализ готов.
Еще одна сфера применения масс-спектрометрии — персонализированная медицина. У нас все вещества попадают в печень, и печень их как-то метаболизирует. Причем печень у всех у нас работает по-разному не только из-за каких-то заболеваний или вредных привычек. Например, на метаболизм может существенно повлиять грейпфрутовый сок, он ингибирует некоторые ферменты и в результате концентрация некоторых лекарств у вас может оказаться в несколько раз выше ожидаемого. У некоторых людей после приема препарата концентрация в крови будет такая, а у других — в два раза выше. Получается, что дозировку нужно уменьшать в два раза, чтобы не наносить лишнего вреда организму. Отсюда и переход к персонализированной медицине. Вы пьете таблетку, у вас отбирают кровь каждый час и смотрят кривую: как у вас вещество путешествует с течением времени по организму, какая у него концентрация в крови. Дальше врач может дозировку скорректировать или вообще отменить вам препарат и назначить другой. И вот в этом случае тоже очень активно применяется анализ сухой крови.
Любое новое лекарство, выходящее на рынок, обязательно проходит стадию исследований метаболизма. Некоторые лекарства могут быть не очень токсичны, но в итоге распада в печени и некоторым ошибкам эти вещества могут превращаться даже в более токсичные. Самый простой пример — это парацетамол. В инструкции к парацетамолу сказано, что его запрещено давать маленьким детям. Что маленьким детям нужно давать только ибупрофен. А причина тому — накопление вот этой молекулы в печени, в результате метаболизма которая обладает токсическим эффектом. Для взрослого человека с его хорошо развитой печенью этот токсический эффект он не сильно заметен, хотя, конечно, глотать парацетамол банками тоже нельзя. То для маленьких детей это, на самом деле, может привести ко всяким неприятным и даже необратимым последствиям. Поэтому каждое новое лекарство обязательно изучается на метаболизм.
Имаджинг — это способ проведения масс-спектрометрического анализа, когда мы получаем информацию не только о гомогенном, но и о гетерогенном образце, причем мы можем изучить его молекулярный состав в пространстве. Есть такой интересный пример по изучению распределения лекарственного средства и его метаболитов в организме крысы. Эксперимент проводится так: крысе дают некое лекарство, после нескольких часов животное подвергают эвтаназии и дальше животное тонко-тонко нарезаются вдоль всего тела. А потом специальная техника масс-спектрометрии позволяет изучить молекулярный состав каждой точки этого образца. После компьютерной обработки можно визуализировать, где какие метаболиты накопились. Важно изучать распределение метаболитов, потому что если вы принимаете препарат от пневмонии, важно, чтобы он оказался в легких, а не в мозге. Масс-спектрометрический скальпель — это «нож», который откачивает молекулы из места разреза, а затем с помощью компьютерных технологий можно определить, какую хирург режет ткань: больную или здоровую. Этот метод сейчас внедряется в США, и уже проведена была первая реальная операция таким ножом.
«Отпечатки пальцев» для каждой молекулы
Проблема в том, что одному элементному составу может соответствовать несколько сотен или даже тысяч химических соединений. Поэтому необходимо идентифицировать все строки таблицы, и это основная задача современного метаболомного анализа, она, к сожалению, до конца не решена. Молекулярные отпечатки сравниваются с теми, которые есть в базах данных химических молекул. Если они совпадают, значит, мы можем с некоторой уверенностью говорить, что это нужная молекула. Но в таких базах данных очень ограниченное количество веществ. Полная база отпечатков содержит в себе около 20–30 тысяч соединений, она даже не покрывает все первичные и вторичные метаболиты, которые есть в организме человека. Есть еще одна проблема: чтобы эту базу данных пополнить, нужно чистое химическое вещество, а они обычно дорогие. То есть одно химическое вещество чистое стоит обычно несколько десятков или сотен долларов.
Один из подходов к идентификации — это создание новых «отпечатков пальцев». Например, сейчас очень активно развивается метод спектрометрии ионной подвижности. Если масс-спектрометрия делит ионы по массе, то ионная подвижность позволяет разделить их по размеру. То есть если у вас есть два бегуна — не тяжелый и легкий, а крупный и мелкий, и на их пути поставить какое-то препятствие — например, сетку с ячейками, то стройный атлет быстро через эту сетку пролезет и до финиша добежит, а полный пока выпутается из этой сети, прибежит через какое-то время.
Второй метод — это попытка найти такие отпечатки пальцев, для определения которых не нужны чистые стандарты. Мы в лаборатории предлагаем использовать так называемый изотопный обмен.
Для идентификации молекул можно применять искусственный интеллект. На основе имеющейся информации можно достроить базы данных недостающей информацией с помощью методов глубинного обучения. То есть мы обучаем модель, и она по структуре молекулы предсказывает необходимые отпечатки, которые дальше мы можем использовать для сравнения с тем, что получено в эксперименте.
Читайте также:
Уран получил статус самой странной планеты в Солнечной системе. Почему?
Люди могут выдерживать очень низкие температуры даже без источников тепла
Физики создали аналог черной дыры и подтвердили теорию Хокинга. К чему это приведет?